rongo

Ko te IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) he tairitenga o te tïpako β-galactosidase, he tino inducible.I raro i te whakaurunga o te IPTG, ka taea e te kaitahuri te hanga he matatini ki te pūmua repressor , Kia huri te ahua o te pūmua repressor, kia kore ai e taea te whakakotahi ki te ira ira, me te whakaatu pai i te ira ira.Na me pehea te whakatau i te kukū o te IPTG i te wa o te whakamatautau?Ko te nui ake te pai ake?
Tuatahi, kia mohio tatou ki te kaupapa o te whakauru IPTG: E. coli's lactose operon (huānga) e toru nga ira hanganga, Z,Y, me A, e whakawaehere ana i te β-galactosidase, permease, me te acetyltransferase, ia.Ka whakamaua e lacZ te lactose ki te huka me te galactose, ki te allo-lactose ranei;Ka taea e te lacY te lactose i roto i te taiao ki te haere i roto i te membrane pūtau ka uru ki roto i te pūtau;Ka whakawhitihia e te lacA te roopu acetyl mai i te acetyl-CoA ki te β-galactoside, e uru ana ki te tango i te paanga Toxic.I tua atu, he raupapa whakahaere O, he raupapa timata P me te ira ture I. Ko te Ira ira waehere he pūmua repressor ka taea te here ki te waahi O o te raupapa kaiwhakahaere, kia peehia te operon (meta) me te whakawetohia.He waahi here ano hoki mo te waahi herenga ira catabolic activator pūmua-CAP te waahi herenga whakarunga o te raupapa timata P. Ko te raupapa P, te raupapa O me te waahi herea CAP te rohe ture o te operon lac.Ko nga ira whakawaehere o nga enzymes e toru ka whakatauhia e te rohe ture kotahi kia tutuki ai te whakaputanga o nga hua ira.

I te kore o te lactose, ko te lac operon (meta) kei roto i te ahua o te peehi.I tenei wa, ko te repressor lac e whakaatuhia ana e te raupapa I i raro i te mana o te raupapa kaiwhakatairanga PI e herea ana ki te raupapa O, e aukati ana i te RNA polymerase mai i te here ki te raupapa P me te whakakore i te timatanga o te tuhi;i te wa e noho ana te lactose, ka taea te whakapouri i te lac operon (meta) I roto i tenei punaha operon (meta), ko te tino kaiwhakaoho ehara i te lactose ake.Ka uru te Lactose ki roto i te pūtau, ka whakakorikorihia e te β-galactosidase kia huri ki te allolactose.Ko te mea whakamutunga, hei ngota inducer, ka herea ki te pūmua repressor me te whakarereke i te ahua o te pūmua, e arai ana ki te wehenga o te pūmua repressor mai i te raupapa O me te tuhi.He rite tonu te painga o te Isopropylthiogalactoside (IPTG) ki te allolactose.He mea whakakorikori tino kaha, e kore e whakakorikoria e te huakita me te tino pumau, no reira ka whakamahia nuitia i roto i nga taiwhanga.

Me pehea te whakatau i te kukū tino pai o te IPTG?Tangohia a E. coli hei tauira.
Ko te E. coli BL21 i hangaia he riaka ira kei roto i te pGEX pai (CGRP/msCT) i werohia ki roto i te reo wai LB kei roto 50μg·mL-1 Amp, ka whakatipuria i te po i te 37°C.Ko te ahurea o runga ake nei i werohia ki roto i nga ipu 10 o te 50mL hou LB wai reo kei roto 50μg · mL-1 Amp i te ōwehenga o 1:100 mo te ahurea roha, a, i te wa ko te uara OD600 he 0.6 ~ 0.8, ka whakauruhia te IPTG ki te kukū whakamutunga.Ko te 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.I muri i te whakaurunga i te pāmahana kotahi me te wa ano, ka tangohia te 1 mL o te wairewa huakita mai i a ia, ka kohia nga pūtau huakita ma te centrifugation ka tukuna ki te SDS-PAGE ki te tātari i te awe o nga rereketanga IPTG rereke ki te whakapuaki pūmua, katahi ka tīpakohia te kukū IPTG me te whakaaturanga pūmua nui rawa atu.
I muri i nga whakamatautau, ka kitea ko te kukū o te IPTG kaore i te nui.Na te mea he paitini te IPTG ki te huakita.Ka nui ake te kukū ka mate ano te pūtau;me te nuinga o te korero, e tumanako ana matou ko te nui ake o nga pūmua whakarewa e whakaatuhia ana i roto i te pūtau, he pai ake, engari i roto i te maha o nga wa ka nui rawa te kukū o te IPTG, ka nui te whakauru o te whakauru.Te tinana, engari kua heke te nui o te pūmua wairewa.Na reira, ko te kukū IPTG tino pai ko te nuinga ehara i te mea nui ake te pai, engari ko te iti iho o te kukū.
Ko te kaupapa o te whakaurunga me te whakatipu i nga riaka i hangaia e te ira ko te whakanui ake i te hua o te pūmua i whäia me te whakaiti i nga utu.Ko te whakapuakitanga o te ira e whaaia ana ehara i te mea e pa ana ki nga ahuatanga o te riaka me te whakaaturanga plasmid, engari na etahi atu tikanga o waho, penei i te kukū o te ira, te pāmahana whakauru me te wa whakauru.Na reira, i te nuinga o te waa, i mua i te whakaputanga me te purea o te pūmua e kore e mohiotia, he pai ki te ako i te wa whakauru, te pāmahana me te kukū IPTG kia taea ai te kowhiri i nga tikanga e tika ana me te whiwhi i nga hua whakamatautau pai.